原核注射實(shí)驗(yàn)

簡要描述：原核注射實(shí)驗(yàn)是一種將外源DNA直接注入受精卵原核（通常為雄原核）中的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用于制備轉(zhuǎn)基因動物模型。注射后，外源基因可隨機(jī)整合到宿主基因組中，并在后續(xù)發(fā)育中穩(wěn)定遺傳。該方法操作簡便、效率較高，是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠等模式生物的常用手段，廣泛應(yīng)用于基因功能研究、疾病模型建立及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。

更新時(shí)間：2025-07-25 13:57:56
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一、技術(shù)定義與核心原理

原核注射是將外源DNA直接注入受精卵的雄性原核（體積較大且易定位），使外源基因隨機(jī)整合至宿主基因組的技術(shù)。其核心機(jī)制包括：

隨機(jī)整合：外源DNA通過非同源末端連接（NHEJ）插入染色體，整合位點(diǎn)與拷貝數(shù)不可控。
原核優(yōu)勢：雄性原核（由精子形成）比雌性原核更易定位，且DNA修復(fù)活性高。
瞬時(shí)表達(dá)窗口：受精卵處于單細(xì)胞期，DNA修復(fù)系統(tǒng)活躍，利于外源片段整合。

生物學(xué)基礎(chǔ)：
受精后12-24小時(shí)為最佳操作窗口（小鼠），此時(shí)原核清晰可見。

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

（一）前期準(zhǔn)備

步驟	關(guān)鍵操作與參數(shù)
載體構(gòu)建	線性化載體（避免質(zhì)粒骨架整合） + 必需元件（啟動子、編碼區(qū)、polyA）
受精卵獲取	超排卵處理雌鼠（PMSG/hCG）→ 與雄鼠合籠→ 取見栓后0.5天的受精卵
顯微注射系統(tǒng)校準(zhǔn)	注射針內(nèi)徑1-2μm，壓力5-10 hPa，單次注射體積2pL（含1-2ng DNA）

（二）注射與胚胎移植

存活率控制：注射后受精卵存活率需＞80%。
移植時(shí)機(jī)：發(fā)育至2細(xì)胞期再移植，可提高著床率。

（三）首建鼠（Founder）鑒定

基因型檢測：

PCR法：提取鼠尾DNA，擴(kuò)增外源基因。
Southern Blot：驗(yàn)證拷貝數(shù)與整合完整性。

表達(dá)驗(yàn)證：

Western Blot（蛋白水平）或RT-PCR（轉(zhuǎn)錄水平）。

首建鼠特性：
每只Founder為獨(dú)立品系（因隨機(jī)整合位點(diǎn)不同），需分別建系。

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原核注射實(shí)驗(yàn)

一、技術(shù)定義與核心原理

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

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